革蘭染色的關鍵步驟是什么
脫色時間的掌握，是革蘭染色成敗的關鍵。
革蘭氏染色四大基本步驟：結晶紫初染、碘液媒染、乙醇脫色、沙黃復染，其中乙醇脫色是關鍵。因為如果脫色過度，有可能會使革蘭氏陽性菌呈假陰性，如果脫色不夠，有可能使革蘭氏陰性菌呈假陽性。
革蘭氏染色是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，革蘭氏染色屬復染法，即將標本固定后，先用龍膽紫染色，加碘液媒染后用酒精脫色，再用蕃紅復染。
拓展資料：
革蘭染色法，由丹麥病理學家Christain Gram于1884年創立，是細菌學中很重要的鑒別染色法，因為通過此法染色，可將細菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。
如果將細菌做革蘭染色，凡是染后菌體呈藍紫色的，稱為“革蘭陽性菌”；菌體是伊紅色，稱“革蘭陰性菌”。無論陽性菌還是陰性菌，都有桿菌和球菌。
葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌是臨床最為常見的病原菌，葡萄球菌屬于革蘭陽性菌，大腸桿菌屬于革蘭陰性菌中的腸桿菌科，除大腸桿菌以外，臨床較常見的腸桿菌科細菌還有變形桿菌屬，沙門菌屬、克霉白菌屬；銅綠假單胞菌是臨床常見的較耐藥革蘭陰性桿菌。
參考資料：革蘭染色_百度百科
酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：
（1）載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌于干凈的載玻片上涂布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種并使其粘附固定。
（2）草酸銨結晶紫染1分鐘。
（3）自來水沖洗，去掉浮色。
（4) 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鐘，傾去多余溶液。
（5）用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。
（6）用蕃紅染液或者沙黃復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區別開。
擴展資料
染色原理：
該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低。
故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。
G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色，呈現藍紫色。
參考資料來源：百度百科-革蘭氏染色法
革蘭氏染色是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，革蘭氏染色屬復染法，即將標本固定后，先用龍膽紫染色，加碘液媒染后用酒精脫色，再用蕃紅復染。
革蘭氏染色最為關鍵的步驟就是脫色，可以說脫色決定了革蘭氏染色的成敗。雖說革蘭氏陽性菌不容易脫色，但如果脫色時間過長，革蘭氏陽性菌依然會被脫去顏色而被誤認為陰性菌，這對細菌鑒定判讀會造成極其重大的影響。因此，脫色必須把握時間，不同標本的脫色時間也應該靈活掌握，這需要深厚的經驗來把握才能染出優秀的片子。一般來說，脫色脫至恰好沒有看得見的紫色脫下為最佳停止脫色的時機。
試述革蘭染色法的步驟，結果及其臨床意義
一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：1）涂片固定。2）草酸銨結晶紫染1分鐘。3）自來水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。5）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。7）蕃紅染色液（稀）染1分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。
具體試驗 流程
1、 取載玻片用紗布擦干，載玻片的一面用marker筆畫一個小圈（用來大致確定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、 涂片：液體培養基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰附近5cm左右打開管蓋；右手持接種環在火焰中燒灼滅菌，等冷卻后從試管中沾取菌液一環，在潔凈無脂的載玻片上涂直徑2mm左右的涂膜，最后將接種環在火焰上燒灼滅菌。固體培養基：先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環取少量菌體，涂在載玻片上，使其薄而均勻。 3、 晾干：讓涂片在空氣中自然干燥。 4、 固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。 5、 染色：將固定過的涂片放報紙上，滴加草酸銨結晶紫液，染1min。 6、 水洗：用水緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。簡單染色結束可觀察細胞形態。 7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、 脫色：吸去殘留水，連續滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無紫色，立即水洗。 9、 復染：滴加蕃紅復染3-5min，水洗。至此，革蘭氏染色結束。
結果：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
其重要的臨床意義在于：1.鑒別細菌 2.選擇藥物 3.與致病性有關：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖，兩者的致病作用不同。
